«Исследование явления биокристаллизации на базе Европейского центра синхротронного излучения» в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 - 2020 годы»

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки
Институт химической физики им. Н.Н.Семенова Российской академии наук
В Институте химической физики им. Н.Н. Семенова РАН реализуется проект «Исследование явления биокристаллизации на базе Европейского центра синхротронного излучения» в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 - 2020 годы», руководитель проекта – зам. дир. ИХФ РАН, д.ф.-м.н. Ю.Ф. Крупянский

 

РЕЗЮМЕ ПРОЕКТА
ЭТАП № 1


Номер Соглашения о предоставлении субсидии: 14.616.21.0070
Тема: «Исследование явления биокристаллизации на базе Европейского центра синхротронного излучения.» Приоритетное направление: Индустрия наносистем (ИН)
Критическая технология: Технологии биоинженерии Период выполнения: 06.05.2016 - 31.12.2017
Плановое финансирование проекта: 13.25 млн. руб.
Бюджетные средства 6.625 млн. руб.,
Внебюджетные средства 6.625 млн. руб.
Получатель: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической физики им. НН.Семенова Российской академии наук
Иностранный партнер: European Synchrotron Radiation Facility
Ключевые слова: Биокристаллизация, прокариотические бактерии, нуклеоид, стресс, клетки-персистеры, структура ДНК в нуклеоиде, калиевые каналы, синхротронное излучение, криоэлектронная микроскопия, тельца включения.

Цель проекта
Проект направлен на решение задачи исследования биокристаллизации нуклеоида бактерий под действием стресса голодания. В этих условиях поддержание упорядоченности внутриклеточных структур обычным путем - за счет постоянного расходования свободной энергии - становится невозможным, и бактерии задействуют другой, энергонезависимый механизм - создание устойчивых молекулярных структур. Так, в бактериях E. coli после 48-часового голодания нуклеоид, в комплексе со стресс-индуцированным белком Dps, переходит в кристаллическое состояние. Задачей проекта является исследование структуры этих образований, в частности, определение конформации ДНК в них, с помощью комбинации методов электронной микроскопии и рентгеновской дифракции на синхротроне ESRF с исследованием бактериальных клеток, содержащих биокристаллы нуклеоида, и кристаллических комплексов ДНК-Dps, синтезированных in vitro. Также ставится задача исследования структуры калиевого канала Kv10.2, важного для многих функций организма, методами электронной микроскопии и рентгеноструктурного анализа.
Целью проекта является определение структуры биокристаллов нуклеоида бактерий E. coli в комплексе со стресс- индуцированным белком Dps для расширения фундаментальных представлений о способах организации и защиты генетического материала в прокариотических клетках. Изучение структуры нуклеоида бактерий под действием различных видов стресса, а также клеток, устойчивых к антибиотикам, будет проводиться с целью раскрытия механизмов и структурных основ устойчивости бактерий к неблагоприятным воздействиям, в том числе к лекарственным средствам, для последующего создания средств противодействия этой устойчивости. Исследование структуры CNBD домена калиевого канала Kv10.2 направлено на углубление понимания механизма функционирования данного канала и создание возможности разработки лекарственных средств, направленных на взаимодействие с ним и лечение заболеваний, связанных с нарушениями его работы.

Основные результаты проекта
Подготовлены популяции бактерий E. coli дикого типа и штаммов-сверхпродуцентов белка Dps под действием стресса голодания. Методом электронной микроскопии показано, что морфология клеток полученных штаммов отличается от морфологии контрольной популяции. Для клеток, оверэкспрессирующих белок Dps, наблюдается конденсация цитоплазмы и увеличение периплазматического пространства, встречаются клетки, полностью заполненные конденсированным хроматином, содержащим упорядоченные структуры микрокристаллов. Проведена 1-ая серия дифракционных экспериментов на синхротроне ESRF с полученными образцами, содержащими бактериальные клетки и кристаллы ДНК-DPS. Для для голодающих клеток штамма BL21-Gold(DE3) с трансформацией и индукцией обнаружены зоны повышенной интенсивности на разрешениях приблизительно 90 и 44 А, период первого пика предположительно обусловлен дифракцией на нанокристаллических комплексах ДНК с белком Dps. Проведено выделение из бактерий E. coli очищенного белка Dps. Проведены электронно-микроскопические исследования калиевого канала Kv10.2 с использованием плазмиды pMT3 в эукариотической клеточной линии COS-7. Экспрессирован в клетках E.coli, выделен и очищен до гомогенного состояния домен CNBD канала Kv10.2. Выполнен аналитический обзор научно-технической литературы и проведены патентные исследования по теме проекта, в результате чего были уточнены методики и подходы к решению поставленных задач.

Подготовлены популяции бактерий E. coli штаммов K12, Top10 и BL21-Gold(DE3), а также штаммов Top10/pBAD-DPS и BL21- Gold(DE3)/pET-DPS, трансформированных плазмидами, содержащими ген Dps под контролем различных промоторов.
Проведена 1-я серия электронно-микроскопических исследований бактериальных клеток, получены данные сравнительного изучения морфологии клеток E. coli штаммов Top10 и BL21-Gold(DE3), оверэкспрессирующих белок Dps либо балластный белок сходного размера для контроля. Показано, что морфология клеток полученных штаммов отличается от морфологии контрольной популяции. Для клеток, оверэкспрессирующих белок Dps, наблюдается конденсация цитоплазмы и увеличение периплазматического пространства, встречаются клетки, полностью заполненные конденсированным хроматином, содержащим упорядоченные структуры микрокристаллов.
Проведён выбор методик подготовки к дифракционному эксперименту образцов, содержащих клетки и кристаллы, и способов их доставки под пучок рентгеновского излучения синхротрона. На основе выбранных методик проведена 1-ая серия дифракционных экспериментов на синхротроне ESRF с полученными образцами, содержащими бактериальные клетки и кристаллы ДНК-DPS. Получены данные для штаммов без трансформации плазмидой и с трансформацией, без индукции и с индукцией повышенной экспрессии белка Dps. Популяции бактерий были исследованы в динамике, в серии состояний от начала культивирования до 8 суток голодания. Обнаружено, что паттерны рассеяния, наблюдаемые для голодающих клеток штамма BL21-Gold(DE3) с трансформацией и индукцией, содержат зоны повышенной интенсивности на разрешениях приблизительно 90 и 44 А, период первого пика предположительно обусловлен дифракцией на нанокристаллических комплексах ДНК с белком Dps. Данные результаты указывают на наличие периодических структур в образцах с голодающими клетками, которые не наблюдаются в образцах стационарной популяции. Сравнение разрешений полученных дифракционных максимумов с литературными данными позволяет сделать предположение о возможной роли белка Dps, связанного со стрессом голодания, и нуклеоида бактерий в формировании упорядоченных структур. Проверка этих гипотез требует проведения дальнейших исследований кристаллизации ДНК в комплексе с Dps in vivo и in vitro.
Проведено выделение из бактерий E. coli трансформированных штаммов очищенного белка Dps. Обнаружено, что в обоих подготовленных штаммах рекомбинантный белок Dps накапливается как в растворимой, так и в нерастворимой фракциях, при этом в нерастворимой фракции белок находится в составе телец включения. Обнаружен высокий выход белка Dps (около половины от суммарного количества белка в штаммах-продуцентах). Подтверждена первичная структура белка Dps, полностью соответствующая нативному белку.
Проведены электронно-микроскопические исследования калиевого канала Kv10.2 с использованием плазмиды pMT3 в эукариотической клеточной линии COS-7. Экспрессирован в клетках E.coli, выделен и очищен до гомогенного состояния домен CNBD канала Kv10.2.
Выполненные исследования и полученные результаты полностью соответствуют требованиям к выполняемому проекту. Полученные результаты являются новыми и соответствуют мировому научному уровню в исследуемой области.

Охраноспособные результаты интеллектуальной деятельности (РИД), полученные в рамках прикладного научного исследования и экспериментальной разработки
На данном этапе охраноспособные РИД не были получены.

Назначение и область применения результатов проекта
Полученные результаты могут расширить фундаментальные представления о способах организации и защиты генетического материала в прокариотических клетках. Они могут быть применены, в частности, при разработке стратегий борьбы с инфекционными заболеваниями. Действительно, в недавних работах было обнаружено, что Dps и его аналоги позволяют патогенным бактериям сопротивляться защитным воздействиям организма-хозяина. Имеются предположения, что одним из механизмов такого сопротивления может быть кристаллизация нуклеоида в комплексе с Dps. Кроме того, исследование структуры генетического материала бактерий под действием различных видов стресса может помочь в понимании механизмов устойчивости патогенных бактерий к антибиотикам, представляющей серьезную медицинскую проблему.
Результаты по структуре калиевых каналов могут быть использованы медицинскими учреждениями и фармацевтическими компаниями, которые разрабатывают лекарственные средства, направленные на взаимодействие с этими каналами и лечение заболеваний, связанных с нарушениями их работы. Для доведения результатов до потребителей требуется проведение ОКР по данной тематике.


Эффекты от внедрения результатов проекта
Возможные формы коммерциализации результатов проекта включают разработку препаратов для лечения заболеваний, вызванных бактериальными инфекциями, а также направленных на взаимодействие с калиевыми каналами и лечение заболеваний, связанных с нарушениями их работы.
Применение полученных результатов в указанных областях в перспективе может позволить создать более эффективные препараты для лечения заболеваний, вызванных бактериальными инфекциями; приблизиться к решению проблемы резистентности патогенных бактерий к антибиотикам; разработать лекарства, направленные на взаимодействие с калиевыми каналами и лечение заболеваний, связанных с нарушениями их работы. В конечном счете это приведет к снижению риска смертности и повышению качества жизни людей.

Формы и объемы коммерциализации результатов проекта
Возможные формы коммерциализации результатов проекта включают разработку препаратов для лечения заболеваний, вызванных бактериальными инфекциями, борьбы с бактериальными клетками, резистентными к антибиотикам, а также направленных на взаимодействие с калиевыми каналами и лечение заболеваний, связанных с нарушениями их работы.

Наличие соисполнителей
На данном этапе соисполнители к работе не привлекались.